Schreyer, Anna-Chi (2014): Charakterisierung des µ-Slides zur Analyse von Chemotaxis: ein Vergleich zur Boyden-Kammer.Dissertation, LMU München: Medizinische Fakultät (2024)

Aus der Klinik und Poliklinik für Hals-Nasen-Ohren-Heilkunde der Ludwig-Maximilians-Universität München

Direktor: Prof. Dr. med. Alexander Berghaus

Charakterisierung des

µ

-Slides zur Analyse

von Chemotaxis:

Ein Vergleich zur Boyden-Kammer

Dissertation

zum Erwerb des Doktorgrades der Medizin

an der Medizinischen Fakultät der

Ludwig-Maximilians-Universität zu München

vorgelegt von Anna-Chi Schreyer

aus München

Mit Genehmigung der Medizinischen Fakultät

der Universität München

Berichterstatter: Prof. Dr. rer. nat. O. Gires

______________________________________

Mitberichterstatter: Prof. Dr. Barbara Walzog

Prof. Dr. ChristianSommerhoff Mitbertreuung durch den

promovierten Mitarbeiter: Dr. med. P. Zengel

Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. M. Reiser, FACR, FRCR

PUBLIKATIONEN

Im Rahmen dieser Doktorarbeit war es mir möglich zu folgender Publikation beizutragen:

Zengel P, Nguyen-Hoang A, Schildhammer C, Zantl R, Valentin K, Horn E (2011) µ-Slide Chemotaxis: A new chamber for long-term chemotaxis studies.

INHALTSVERZEICHNIS

PUBLIKATIONEN...3

1 EINLEITUNG...6

1.1

Definition der Chemotaxis...7

1.2

Entwicklung von in-vitro-Systemen zur Messung von

Chemotaxis...7

1.3

Boyden-Kammer...10

1.4

Zigmond-Kammer...11

1.5

µ

-Slide Chemotaxis...13

1.6

Zielsetzung...13

2

MATERIAL...15

2.1

Chemikalien, Verbrauchsmaterialien, Geräte...15

2.1.1 Chemikalien...15

2.1.2 Verbrauchsmaterialien...15

2.1.3 Geräte...16

2.2

Zelllinien...16

3

METHODEN...17

3.1

Zellkultur...17

3.1.1 Zellkulturbedingungen: Kultivierung und Aufbewahrung

permanenter Zelllinien...17

3.1.2 Bestimmung der Zellzahl...18

3.2

Migrationsversuche...18

3.2.1 Boyden-Kammer...18

3.2.1.1

Versuchsaufbau und -durchführung...19

3.2.1.2

Auswertung...20

3.2.2

µ

-Slide Chemotaxis...21

3.2.2.1

µ

-Slide Chemotaxis Standardprotokoll...22

3.2.2.3 Auswertung und Datenanalyse...25

4

ERGEBNISSE...29

4.1

Zellmigration in der Boyden-Kammer...30

4.1.1 Einfluss von FCS auf die Migration von

HT-1080 Zellen...30

4.1.2 Einfluss von konditioniertem FaDu-Überstand auf die

Migration von HUVEC...33

4.2

Migrationsverhalten im

µ

-Slide...

..

34

4.2.1 Direkte Migration von HT-1080 Zellen auf ein Gradient

aus FCS...35

4.2.2 Direkte Migration von HUVEC im

µ

-Slide...40

5

DISKUSSION...43

5.1

Bewertung der Ergebnisse...44

5.1.1 Chemotaxis in der Boyden-Kammer...44

5.1.2 Chemotaxis im

µ

-Slide...45

5.1.3 Boydenkammer- und

µ

-Slide-Ergebnisse im Vergleich..49

5.2

Vor- und Nachteile beider Systeme...51

6

ZUSAMMENFASSUNG...55

7

LITERATURVERZEICHNIS...56

1 EINLEITUNG

Heute ist bekannt, dass Chemotaxis, i.e. die zielgerichtete Zellmigration auf einen Lockstoff, in vielen physiologischen und pathologischen Prozessen wie Infektionsbekämpfung, Angiogenese, Tumorwachstum und -metastasierung eine zentrale Rolle spielt (Zeller, Skalak et al. 2001, Olson and Ley 2002, Navenot, Fujii et al. 2009).

Beispielsweise wird Neoangiogenese, die Neubildung von Blutgefäßen, über die Produktion chemotaktischer Faktoren gesteuert. Wachstumsfaktoren wie z. B. vascular endothelial growth factor (VEGF) und basic fibroblast growth factor (bFGF) bewirken über Endothelproliferation und -migration die Bildung neuer Blutgefäße (Reinmuth, Parikh et al. 2003). Neovaskularisation ist ausschlaggebend für Tumorwachstum und Metastasierung (Folkman 1986). In vivo Beobachtungen haben gezeigt, dass schnelles Wachstum eines Tumors erst dann stattfinden kann, sobald Neovaskularisation eintritt. Tumore, die eine Größe von 1,5 mm3 überschreiten, können Nährstoffe nicht mehr ausschließlich über Diffusion aufnehmen, sondern bedürfen einer eigenen Blutversorgung (Folkman 1990, Fidler and Ellis 1994). Darüber hinaus ermöglicht die Blutversorgung Tumorzellen in die Blutbahn einzutreten, zu zirkulieren und, nach einer Extravasation in ein lokoregionales oder fernes Gewebe, Metastasen zu bilden (Ratajczak, Lewis et al. 1986).

Gleichermaßen spielt Chemotaxis bei der Akkumulierung von Leukozyten am Entzündungsort im Rahmen einer Immunantwort eine entscheidende Rolle. Die Migration von Leukozyten wird über eine Vielzahl von Lockstoffen, die am Infektionsort ausgeschüttet werden, reguliert. Während eine kontrollierte Ansammlung von Leukozyten am Entzündungsherd durchaus erwünscht wird, führt eine überschießende Rekrutierung dieser Zellen zu Gewebszerstörung und chronisch entzündlichen Krankheiten (Norman and Kubes 2005).

Testverfahren zur detaillierten Beobachtung chemotaktisch aktiver Zellen geht bis ins 19. Jahrhundert zurück. Derzeit gilt die Boyden-Kammer als Goldstandard für die Messung der Chemotaxis in vitro. Dennoch weist diese Methode Nachteile auf, was die Suche nach einem neuen Verfahren erfordert.

1.1 Definition der Chemotaxis

Chemotaxis bezeichnet das gerichtete Wandern von Lebewesen oder Zellen in Abhängigkeit eines Konzentrationsgradienten. Dabei lassen sich zwei Arten von Chemotaxis unterscheiden. Geht die Bewegung Richtung stimulierende Substanz spricht man von positiver Chemotaxis und die betreffende Substanz wird Lockstoff oder Attraktans genannt. Ist die Bewegung des Organismus oder der Zelle auf Grund des Attraktans in die entgegengesetzte Richtung gerichtet, spricht man von negativer Chemotaxis und nennt die betreffende Substanz Schreckstoff oder Repellent. Chemokinese hingegen beschreibt eine ungerichtete, zufällige Bewegung der Zelle, als Antwort auf eine Substanz (Becker 1977).

1.2 Entwicklung von in-vitro-Systemen zur Messung

von Chemotaxis

Leukozyten am Injektionsort (Leber 1888). Seitdem wurde eine Vielzahl an Methoden entwickelt um Chemotaxis in vivo und in vitro zu messen.

Leber inji*zierte verschiedene Testsubstanzen nicht nur direkt in die Kaninchenaugen, sondern bediente sich auch kleiner mit Testsubstanz gefüllten Kapillarröhrchen, die er in die Vorderkammer von Kaninchenaugen einbrachte, um so die chemotaktische Wirkung der Substanzen auf Leukozyten zu testen (Leber 1891). Anschließend wurden die Kapillarröhrchen wieder entfernt, der Inhalt ausgedrückt, und die Leukozytenzahlen untereinander verglichen. Diese Methode war allerdings mit einigen Fehlern behaftet. Es zeigte sich, dass die Leukozyten nicht nur durch amoeboide Bewegungen in die Röhrchen migrierten, sondern auch einfach nur aufgrund osmotischer Druckunterschiede zwischen Röhrchen und umgebendem Gewebe eingeschwemmt wurden. Unter diesen Umständen wurden neben Leukozyten auch Erythrozyten in den Röhrchen gefunden, die offensichtlich nur passiv in die Röhrchen gelangten (Pfoehl 1898, Ruchlädew 1910).

Auf Grund dieser Fehlerquellen der Methode nach Leber wurde nach einer Methode gesucht, die Leukozyten daran hindern sollte passiv aufgrund osmotischer Druckunterschiede zur Testsubstanz zu migrieren und es erlaubt ihre aktiven Bewegungen zu dokumentieren. Clark et al. inji*zierten Testsubstanzen wie Stärke oder Krotonöl in transparente Kaulquappenschwänze und konnten so unter dem Mikroskop amoeboide Bewegungen von Leukozyten in Richtung Lockstoff beobachten (Clark and Clark 1920, Clark and Clark 1922). Aber auch diese Methode zeigte gewisse Nachteile. Bereits die kleinste Irritation, sogar die Injektion selbst, führte zu verstärkter Zellmigration, so dass der eigentliche Beitrag von Testsubstanzen nur schwer nachvollziehbar war.

Möglichkeit einzelne Leukozyten unter dem Mikroskop direkt beobachten zu können (Grimes and Barnes 1973).

Bis zu diesem Zeitpunkt wiesen alle Testverfahren ein gemeinsames Defizit auf. Es ließ sich bei keiner der genannten Methoden eine Aussage über den Konzentrationsgradienten des Lockstoffes treffen.

1974 beschrieben Cutler et al. die Agarose-Methode (Cutler and Munoz 1974). Die Methode bestand aus einem Deckglas, welches mit einer Agarosegelschicht benetzt wurde. Anschließend wurden drei runde Vertiefungen in einer Reihe und in gleichen Abständen zueinander gestanzt. Die mittige Vertiefung wurde mit Zellen, die verbliebenen Vertiefungen mit einer Lockstoff- oder Kontrollsubstanz versehen. Über Diffusion des Chemoattraktans und der Kontrolllösung durch das Gel entstand nun ein exponentieller Konzentrationsgradient, welcher die Zellen dazu veranlasste durch die Agarose Richtung Lockstoff zu wandern (Foxman, Campbell et al. 1997). Nach einer definierten Inkubationszeit wurden die Zellen fixiert, die Agarose entfernt und das Deckglas gefärbt. Die Auswertung erfolgte über die Messung der Distanz, welche die Zellen Richtung Lockstoff oder Kontrolllösung zurückgelegt hatten. Dabei konnte entweder der Chemotaxisindex, welcher sich als Verhältnis der zurückgelegten Distanz zum Lockstoff und zum Kontrollstoff errechnete, oder die Chemotaxisdifferenz ermittelt werden, welche man aus der Distanz zum Lockstoff nach Abzug der Distanz zum Kontrollstoff erhielt (Chenoweth, Rowe et al. 1979).

1.3 Boyden-Kammer

Eines der meist genutzten Systeme für Chemotaxisversuche in der Zellbiologie heute und zugleich Pionier einer andauernden Entwicklung sogenannter 2-Kammer-Systeme, war die von Steve Boyden entwickelte Boyden-Kammer (Boyden 1962).

Die Boyden-Kammer ist ein Zellkulturgefäß, das aus zwei Kompartimenten besteht, welche wiederum durch eine mit definierten Mikroporen (Größe von 5 bis 10 µm) durchsetzte Membran getrennt werden. Zu Beginn wird eine Lockstoff-enthaltende Lösung in das untere Kompartiment pipettiert. Das obere Kompartiment, dessen Boden eine porige Membran darstellt, wird mit Zellen versehen und in die untere Kammer gesetzt. Dabei kann nun die chemotaktische Lösung durch die Membran in die obere Kammer diffundieren und erzeugt so einen Konzentrationsgradienten, der die Zellen der oberen Kammer dazu bringt durch die Poren der Membran zu migrieren. Nach einer definierten Inkubationszeit werden die Zellen, die auf die Unterseite der Membran migriert sind, fixiert, gefärbt und gezählt.

Abbildung 1.1 Schematische Darstellung einer Boyden-Kammer im Querschnitt mit (1) oberem und

(2) unterem Kompartiment. Zellmigration findet von oben nach unten statt (Gostner, Fong et al. 2011).

sowie verschieden beschichtete Membranen (Zellulose/Nitrate oder Polycarbonate) unterschiedlicher Dicke wurden getestet.

Die einfache Handhabung und die Bereitstellung eines quantitativen Maßes für chemotaktisch induzierte Zellmigration haben die Boyden-Kammer zum Goldstandard für Chemotaxisversuche in der Zellbiologie gemacht. Hingegen ihrer Beliebtheit weist die Boyden-Kammer einige Nachteile auf, die unter anderem in dieser Arbeit diskutiert werden sollen.

Eine Weiterentwicklung der Boyden-Kammer und zugleich der Grundstein des neu entwickelten Chemotaxis-Assays stellt die Zigmond-Kammer dar.

1.4 Zigmond-Kammer

Sally Zigmond entwickelte 1977 ein System, das erstmals eine direkte Beobachtung von Zellen während der Migration in Abhängigkeit gut definierter Gradienten zuließ (Zigmond 1977).

Die Kammer besteht aus einem Plexiglas-Objektträger, welcher mit zwei parallel angebrachten Vertiefungen versehen ist. Die beiden Kanäle werden durch eine „Brücke“ getrennt, welche 3-10 µm unter der Oberfläche des Objektträgers liegt. Ein mit Zellen versehenes Deckglas wird kopfstehend auf die Kanäle gelegt und bildet so eine 3-10 µm hohe und 1 mm breite Lücke zwischen dem Deckglas und der Brücke. Das Deckglas wird über 2 Klammern, welche jeweils an den Enden des Objektträgers befestigt sind, gehalten. Füllt man nun die beiden Kanäle mit Medien unterschiedlicher Konzentration wird durch Diffusion ein linearer Gradient über der Brücke erzeugt (Crank 1964, Cussler 1997).

Veränderungen von Wachstum, Differenzierung oder Migration individueller Zellen können mit Hilfe eines Mikroskops über dem Brückenbereich direkt beobachtet werden. Im Gegensatz zu bisherigen Chemotaxis-Assays können in der Zigmond-Kammer reproduzierbare und mathematisch berechenbare Gradienten erzeugt werden. Allerdings ist die Dauer dieses Fließgleichgewichtes aufgrund der endlichen Volumina und gewisser Volumenverluste durch Verdunstung auf ca. 60-90 Minuten begrenzt (Zigmond 1977). Mit einer Dicke von über 3 mm und der Anfertigung aus Polymethylmethacrylat (PMMA) ist die Zigmond-Kammer nicht für die inverse Mikroskopie geeignet, so dass Videomikroskopie, welche gewöhnlich mit inversen Mikroskopen durchgeführt wird, nicht angewendet werden kann.

Nach dem gleichen Prinzip, aber mit unterschiedlicher Geometrie, funktioniert die Kammer (Zicha, Dunn et al. 1997). Die zwei Vertiefungen der Dunn-Kammer sind im Gegensatz zur Zigmond-Dunn-Kammer konzentrisch. Die „Brücke“, welche die Vertiefungen voneinander trennt, dementsprechend ringförmig. Auch hier werden die Vertiefungen mit Chemoattraktans gefüllt sowie ein mit Zellen versehenes Deckglas aufgelegt. Die Lockstoffe diffundieren zwischen den Vertiefungen und erzeugen so einen stabilen Gradienten über der Brücke. Das Prinzip zur Erzeugung des Gradienten gleicht demnach dem der Zigmond-Kammer. Der wesentliche Unterschied liegt in der Brückenregion, welche bei der Zigmond-Kammer einen dünnen Film, bei der Dunn-Kammer eher eine zylindrische „Mauer“ darstellt. Im Vergleich zur Zigmond-Kammer verfügt die Dunn-Kammer über eine präzisere und komplett abgeschlossene Konstruktion, welche einen stabileren Gradienten ermöglicht (Zicha, Dunn et al. 1997). Hinzu kommt, dass die Dunn-Kammer, im Gegensatz zu der aus 3 mm dickem Plexiglas angefertigten Zigmond-Kammer, komplett aus 1 mm dickem Glas hergestellt ist, so dass sie auch für andere lichtmikroskopische Verfahren wie die inverse Mikroskopie, geeignet ist (Zicha, Dunn et al. 1991).

1.5

µ

-Slide Chemotaxis

Das µ-Slide Chemotaxis ist eine Chemotaxis-Kammer, welche auf dem Prinzip der Zigmond-Kammer basiert. Anders als die Zigmond-Kammer besteht das µ-Slide aus einem Stück und wurde für inverse Mikroskope entworfen. Das µ-Slide besteht aus zwei Reservoiren, die in der Mitte über einen „Beobachtungskanal“ verbunden sind. Durch Füllen der Reservoire mit unterschiedlichen Konzentrationen eines Lockstoffes wird über Diffusion ein bis zu 48 Stunden linearer sowie stabiler Gradient über dem Beobachtungskanal aufgebaut. Die im Kanal befindlichen Zellen sind zwei entgegengesetzten Gradienten ausgesetzt. Über Videomikroskopie ist die genaue Verfolgung und Analyse einzelner Zellbewegungen möglich.

Abbildung 1.3 Schematische Darstellung eines µ-Slides Chemotaxis mit einem (1)

Beobachtungskanal und zwei (2,3) Reservoiren.

1.6 Zielsetzung

2 MATERIAL

2.1 Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Geräte

2.1.1 Chemikalien

Tabelle 2.1 Verwendete Chemikalien

Artikel Firma

Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) DMSO

Eosin

Endothel Cell Growth Medium (ECGM) EDTA

Fetal Calf Serum (FCS) Glyzerol

Methanol

Mayer’s Hämalaun Lösung

Phosphat buffered saline (PBS-) Tabletten Penicillin, Streptomycin

Trypanblau Trypsin

Biochrom AG, Berlin Merck, Darmstadt

Chroma-Gesellschaft, Köntgen/N. Promocell GmbH, Heidelberg Roth, Karlsruhe

Biochrom, Berlin Sigma, Taufkirchen Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Gibco BRL, Karlsruhe Biochrom AG, Berlin Biochrom AG, Berlin Biochrom AG, Berlin

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 2.2 Verwendete Verbrauchsmaterialien

Artikel Bezugsquelle

Kanülen Kryogefäße

Migrationskammern (Chemotaxis µ-slide) Objektträger „Superfrost“

Pipettenspitzen

Pipettenspitzen (gestopft) Röhrchen, steril, Zellkultur Skalpelle

BD, Heidelberg Nunc, Wiesbaden Ibidi, Martinsried Nunc, Wiesbaden Gilson, Bad Camberg

Tiefkühlgefäße/Kryoröhrchen Zellkultur-Inserts (8,0 µm)

Zellkultur-Multiloch-Platten (12 Well) Zellkulturflaschen und –schalen Zentrifugengefäße 1,5 / 2ml

Nunc, Wiesbaden Falkon/BD, Heidelberg Falkon/BD, Heidelberg Nunc, Wiesbaden Eppendorf, Hamburg

2.1.3 Geräte

Tabelle 2.3 Verwendete Geräte

Artikel Bezugsquelle

CCD-Kamera

Fluoreszenzmikroskop „Axiovert 200“

Gefrierschrank (-20°C, -80°C)

Glaswaren Schott

Heiz- und Inkubationsystem (37°C)

Inverses Mikroskop Eclipse Ti Inkubator für Zellkultur, CO2-begast Konfokales Laserscan Mikroskop (KLSM)

Kühlschrank (4°C)

Mikroliter-Pipetten Mikrowelle

Phasenkontrastmikroskop Standard 25 Stickstoff-Kühllagereinrichtung Waage CP 4202 S

Zentrifugen

Orca, Hamamatsu, Japan Carl Zeiss, Jena

Liebherr, Ochsenhausen Roth, Karlsruhe

Ibidi GmbH, Martinsried Nikon, Düsseldorf Heraeus, München Carls Zeiss, Jena Liebherr, Ochsenhausen Abimed, Langenfeld AEG, Berlin Zeiss, Halbergmoss

Messer Cryotherm, Kirchen/Sieg Sartorius, Göttingen

Eppendorf, Hamburg

2.2 Zelllinien

Tabelle 2.4 Verwendete Zelllinien

Zelllinie Herkunft Referenz

FaDu HT-1080 HUVEC

Hypopharynx-Karzinomzelllinie Fibrosarkomzelllinie

Primäre Endothelzellen der menschlichen Nabelschnur (Human umbilical vein endothelial cells)

ATCC HTB-43 ATCC CCL-121 Lonza, Verviers, Belgien

3 METHODEN

3.1 Zellkultur

3.1.1 Zellkulturbedingungen: Kultivierung und Aufbewahrung

permanenter Zelllinien

Alle Zelllinien wurden in einem Inkubator bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% CO2 und 95% Luftfeuchtigkeit gehalten. Als Standardmedium für FaDu- und

HT-1080 Zellen wurde Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM), supplementiert mit 10% Fetal Calf Serum (FCS) und Antibiotika (100 µg/ml Streptomycin, 100 U/ml Penicillin) benutzt. Für HUVEC-Zellen wurde Endothel Cell Growth Medium (ECGM) verwendet. Adhärente FaDu- und HT-1080 Zellen wurden alle 2-3 Tage, HUVEC alle 10 Tage zur Subkultivierung zunächst mit 10 ml PBS serumfrei gewaschen und anschließend mit 2 ml Trypsin-EDTA von der Kulturflasche gelöst. Die Zellsuspension wurde 1:10 mit frischem Medium verdünnt oder für weitere Versuche in gewünschter Dichte ausplattiert. Alle nötigen Zentrifugationsschritte wurden bei 280 Umdrehungen/min für 5 min bei 20°C durchgeführt. Für alle Experimente wurden nur die ersten drei Passagen isolierter HUVEC verwendet.

Zur Aufbewahrung der Zelllinien wurden jeweils 106-107 Zellen mit PBS gewaschen und anschließend in 1 ml Einfriermedium aufgenommen. Diese Suspension wurde in ein 1,8 ml Kryogefäß überführt und in einem verschließbaren Styroporbehälter in einem -80°C Gefrierschrank langsam eingefroren. Am folgenden Tag wurden die Zellen zur dauerhaften Lagerung in einen mit flüssigem Stickstoff gefüllten Lagertank überführt.

3.1.2 Bestimmung der Zellzahl

Die Zellzahlen wurden in einer Rosenthal-Kammer bestimmt. Die Fuchs-Rosenthal-Kammer hat eine Zählfläche von 4 x 4 Quadraten mit einer Kantenlänge von jeweils 1 mm und eine Kammertiefe von 0,2 mm. Um lebende von toten Zellen zu unterscheiden, wurden die Zellen 1:1 mit einer 0,2%-igen Trypanblaulösung gemischt. Während tote Zellen den blauen Farbstoff aufnehmen, bleiben lebende Zellen farblos. Anschließend wurden 20 µl des Zellen-Trypanblau-Gemischs in die Zählkammer gegeben und die Zellen in 4 Quadranten unter dem Mikroskop ausgezählt. Die gesamte Zellzahl wurde wie folgt berechnet:

Zellen pro 1 ml = _{ausgezählte Fläche x Kammertiefe x Verdünnung =} ausgezählte Zellen

= ausgezählte Zellzahl x 104 x 2

Für µ-Slide Versuche wurde eine Zellkonzentration von 3x106 Zellen/ml, für Versuche in der Boyden-Kammer eine Konzentration von 2x105 Zellen/ml gewählt.

3.2 Migrationsversuche

3.2.1 Boyden-Kammer

die Poren auf die Unterseite der Membran gelangen. Die Auswertung erfolgt rein quantitativ über die Ermittlung der Zellzahl auf der Unterseite der Membran.

3.2.1.1 Versuchsaufbau und -durchführung

Zur Bestimmung der chemotaktischen Wirkung eines Stoffes auf eine bestimmte Zellpopulation wurden Boyden-Kammern im 12 Well Format mit Zellkultur-Inserts mit einer Porengröße von 8,0 µm verwendet. Hierfür wurden die Kammern für die einzelnen Versuche mit einer Pinzette aus der Verpackung entnommen und in eine 12-Loch-Platte überführt. Der dadurch entstandene Raum zwischen dem Zellkultur-Insert und der Loch-Platte bildet dabei das untere Kompartiment, welches zuvor mit einem Lockstoff befüllt wird. Das Insert, dessen Boden aus einer porigen Membran besteht, bildet das obere Kompartiment.

A B

Abbildung 3.1 Darstellung einer Boyden-Kammer. (A) Schematische Darstellung einer

Boyden-Kammer im Querschnitt. (B) Fotografie eines Zellkultur-Inserts, eingehängt in eine 12-Well-Platte.

(-/-), bestehend aus zwei mit Hungermedium gefüllten Kammern, sowie eine Positivkontrolle (+/+), deren Kammern beide Vollmedium (DMEM + 10% FCS) enthielten. Bei der Versuchsreihe mit HUVEC wurde statt der Positivkontrolle (+/+) eine weitere Lockstoffmessung mit 1,5 ml Überstand gehungerter FaDu-Zellen durchgeführt. Hierfür wurden FaDu-FaDu-Zellen über 24 h in Hungermedium kultiviert. Anschließend wurde die 12-Well-Platte mit den Boyden-Kammern mit dem zugehörigen Deckel verschlossen und ab dem Zeitpunkt des Befüllens 6 h im Brutschrank inkubiert.

Nach 6 h Inkubationszeit wurden die Membranen der Boyden-Kammern einer Färbeprozedur unterzogen. Hierfür wurden die Kammern nacheinander einzeln mit einer Pinzette aus der Loch-Platte genommen und die Membranen vorsichtig oben und unten mit PBS abgewaschen. Unter dem Mikroskop wurde die Oberseite der Membran betrachtet. Befanden sich auf der Oberseite der Membran Zellen, wurden diese vorsichtig mit einem Wattestäbchen abgestreift. Anschließend wurden die Zellen 2 Minuten in 10%-igem Methanol fixiert und erneut mit PBS gewaschen. Die fixierten Zellen wurden 10-15 Minuten mit Trypanblau gefärbt und anschließend die überschüssige Farbe mit Wasser weggespült. Die Membranen wurden mit einem Skalpell aus ihrer Halterung herausgeschnitten und auf einem Objektträger in Kaisers Glyzerine fixiert. Die so entstandenen Präparate konnten dann unter dem Mikroskop ausgewertet werden.

3.2.1.2 Auswertung

Zellen auf der Membran nicht gleichmäßig verteilt, wurde die gesamte Membran ausgezählt.

3.2.2

µ

-Slide Chemotaxis

Das µ-Slide Chemotaxis der Firma Ibidi ist ein speziell für Untersuchungen der Chemotaxis entwickeltes Kammersystem. Das Slide hat die Größe eines Objektträgers und besteht aus Deckglas-ähnlichem und biokompatiblem Kunststoff. Aufgrund der glasähnlichen Autofluoreszenz, den Transmissionseigenschaften, und einem Brechungsindex von n=1,5 ist die Kammer auch für inverse Mikroskopie geeignet. Der Aufbau des Systems ist in Abbildung 3.3 schematisch dargestellt.

Abbildung 3.2 Schematische Darstellung des µ-Slides von Ibidi. (A) 3D-Ansicht der Kammer. Der

kleine Beobachtungskanal im Zentrum verbindet die beiden großen Reservoire. (B) Querschnitt eines µ-Slides. Die adhärenten Zellen im Beobachtungskanal werden von einer Seite einem Lockstoff ausgesetzt. (C) Vergrößerung des Beobachtungskanals. (D) Fotografie eines µ-Slides Chemotaxis mit drei Chemotaxis-Kammern, welche mit Lebensmittelfarbe gefüllt sind [Ibidi GmbH, 2010].

µm hohen Beobachtungskanal verbunden werden. Das Fassungsvermögen des Kanals beträgt 6 µl, das der beiden Reservoire jeweils 40 µl. Über angrenzende Einfüllkamine können die Reservoire sowie der Beobachtungskanal mit unterschiedlichen Substanzen bzw. mit den zu untersuchenden Zellen befüllt werden.

3.2.2.1

µ

-Slide Chemotaxis Standardprotokoll

Zellmedien, µ-Slide und die dazugehörigen Stöpsel wurden am Vortag des Experimentes zur Gas Equilibrierung in einen Brutschrank mit einer Atmosphäre von 37°C und 5% CO2 gestellt. Zellmediengefäße wurden dazu leicht geöffnet.

Als erstes wurde der Beobachtungskanal befüllt. Dafür wurde eine Zellsuspension (HUVEC oder HT-1080 Zellen) mit Nährmedium (ECGM oder DMEM + 10% FCS) von 3x106Zellen/ml benötigt. Zunächst wurden bei allen drei Systemen des µ-Slides die beiden Reservoir-Kamine (6, 7 Abbildung 3.4) mit den zugehörigen Stöpseln verschlossen. Nun wurde mit einer 20 µl-Kolbenhubpipette ein 6 µl-Tropfen der Zellsuspension auf den einen Kamin (4) des Beobachtungskanal gesetzt und anschließend vom gegenüberliegenden Kamin (5) des Kanals her vorsichtig angesaugt.

Abbildung 3.3 Schematische Darstellung einer µ-Slide-Kammer beim Befüllen des

Beobachtungskanals. Kammer mit Beobachtungskanal (1), Reservoiren (2,3), kleine Seitenkanäle mit

Zur Adhäsion der Zellen wurde das µ-Slide nun für 4 h in einen Brutschrank gestellt. Für Chemotaxis-Versuche wurde anschließend das Nährmedium im Kanal gegen Hungermedium mit der gleichen 6 µl-Tropfen-Ansaugmethode wie beim Erstbefüllen des Kanals ausgetauscht. Im nächsten Schritt wurden die Reservoire befüllt. Dazu wurde ein Kamin des Kanals (5) und der Kamin eines Reservoirs (6) mit Stöpseln verschlossen. Anschließend wurden 40 µl Hungermedium mittels Pipette durch den offenen Kamin des Kanals (4) vorsichtig eingefüllt. Sobald sich auf dem Kamin des befüllten Reservoirs ein Tropfen gebildet hatte, wurde das Befüllen beendet. Zum Befüllen des anderen Reservoirs wurde dessen Kaminstöpsel auf den Kamin des vollen Reservoirs (7) versetzt. Das Befüllen des zweiten Reservoirs erfolgte äquivalent zu dem des ersten Reservoirs.

Der letzte Schritt galt dem Befüllen eines Reservoirs mit Lockstoff. Dazu wurden beide Kamine des Beobachtungskanals (4, 5) mit Stöpseln verschlossen. Auf den Kamin eines Reservoirs wurde mit einer Pipette ein 18 µl-Tropfen des Lockstoffs (FCS) gesetzt und anschließend dieselbe Menge Flüssigkeit aus dem anderen Reservoir abgesaugt. DMEM mit 0,1% Kälberserumalbumin wurde als Lockstofffreies Medium (Hungermedium = C0), FCS als Lockstoff benutzt.

Die Kammern eines µ-Slides mit HT-1080 Zellen oder HUVEC im Beobachtungs-kanal waren wie folgt befüllt:

Tabelle 3.1 Füllzustände eines µ-Slides Chemotaxis mit HT-1080 Zellen oder HUVEC

Beobachtungkanal Reservoire 1 Reservoire 2

Negativkontrolle (-/-) HT-1080 Hungermedium Hungermedium Positivkontrolle (+/+) HT-1080 Lockstoff Lockstoff

Lockstoffmessung (+/-) HT-1080 Lockstoff Hungermedium

Negativkontrolle (-/-) HUVEC Hungermedium Hungermedium Lockstoffmessung (+/-) HUVEC Lockstoff Hungermedium

Lockstoffmessung (FaDu/-) HUVEC FaDu Hungermedium

18 µl einer 8,5 x 105 Zellen/ml FaDu-Zellsuspension befüllt. FaDu-Zellen wurden in Hungermedium in eines der Reservoire eingebracht und waren bis zu Beginn des Experimentes adhärent auf dem Boden der Chemotaxis-Kammer.

Abbildung 3.4 Querschnitt einer µ-Slide Kammer mit HUVEC im Beobachtungskanal und

FaDu-Zellen in einem Reservoir zur Testung der chemoattraktiven Wirkung von löslichen Faktoren der FaDu- Zellen auf HUVEC.

3.2.2.2 Mikroskopie und Lebendzellabbildung

Sobald alle Kammern befüllt waren, wurde das µ-Slide unter ein Mikroskop mit einer Lebendzellkammer (Temperatur und CO2- Versorgung entsprechen denen

in einem Inkubator) gesetzt.

Abbildung 3.5 Fotografie eines µ-Slides auf dem Mikroskop [Ibidi GmbH, 2010].

liegenden Kammern befand. Die Position des Tisches wurde so festgelegt, dass sich der erste Beobachtungskanal des Slides unter dem Mikroskop befand. Anschließend positionierte der Tisch den zweiten und den dritten Kanal über das Mikroskop. In vorgegebenen Zeitintervallen wurden Aufnahmen von jedem Beobachtungskanal gemacht. Bei einem Beobachtungszeitraum von 24 Stunden wurde ein Aufnahmeintervall von 10 Minuten gewählt. Dies ermöglichte die Beobachtung aller drei Kammern eines Slides innerhalb eines Experimentes. Die Software ordnete jede Aufnahme ihrer zugehörigen Kammer der Reihe nach zu. Pro Kammer wurden 144 Aufnahmen (24 Stunden x 60 min ÷ 10 min) gemacht, die der Reihe nach abgespielt, einen Film wiedergaben.

Abbildung 3.6 Mikroskopische Aufnahme eines Beobachtungskanals. (A) Repräsentative

mikroskopische Aufnahme von HUVEC im Beobachtungskanal (2 mm x 1 mm) zu Beginn des Experimentes und (B) nach 24 h mit farbiger Markierung der Laufwege der Zellen.

3.2.2.3 Auswertung und Datenanalyse

starben, sich teilten, oder den Beobachtungskanal verließen, wurden von der Auswertung ausgeschlossen. Durch die Kalibrierung des objektivspezifischen µm/Pixel Werts konnten die Positionslisten der Zellen von Pixelwerten in Positionsangaben in [µm] umgerechnet werden.

Für eine weiterführende Analyse und Bewertung des chemotaktischen Prozesses wurde eine frei verfügbare Software, welche als Image J plugin fungiert, entwickelt. Das „Chemotaxis and Migration Tool“ liefert unterschiedliche und auf den Daten des Experimentes basierende graphische Auswertungen sowie statistische Tests. Hierfür wurde die entsprechende „manual tracking“ Ergebnisdatei direkt in das Chemotaxis- und Migration-Tool importiert und die Bildspuren der Zellen auf (x=0, y=0) zum Zeitpunkt 0 h normiert.

Für die Quantifizierung von Chemotaxis und Migration wurden folgende Werte durch das Programm errechnet:

- Center of mass (Schwerpunkt der Streckenendpunkte)

- x-FMI (Forward Migration Index, x-Abschnitt der zurückgelegten Distanz)

- y-FMI (Forward Migration Index, y-Abschnitt der zurückgelegten Distanz)

- Rayleigh-Test

- Zellgeschwindigkeit

Abbildung 3.7 Graphische Darstellung eines Migrationsverlaufs. Die Startpunkte jeder Zelle wurden auf (x i,start, y i,start) = (0,0) zum Zeitpunkt t=0 normiert [Zengel et al. 2011]

Center of mass (M

end

)

Der Center of mass (COM) gibt den Schwerpunkt der Streckenendpunkte aller Zellen an. Sein x- und y-Wert gibt die Richtungstendenz der beobachteten Zellen an.

x und y forward migration indices (x-FMI, y-FMI)

(Fisher 1993, Foxman, Kunkel et al. 1999)

Die x-FMI und y-FMI geben die zurückgelegte Distanz der Zellen im Bezug auf die x- und y-Achse an. Je größer der Index einer Achse, desto stärker ist auch die chemotaktische Wirkung entlang dieser Achse. Der Einfachheit halber wird der Verlauf der y-Achse parallel, die der x-Achse senkrecht zum Gradienten gesetzt. Demnach gilt y-FMI = FMIII und x-FMI = FMI⊥.

M_end=1

n _i=1(xi,end,yi,end)

x

_FMI

=

1

n

x

i,end

d

i,accumi=1

n

∑

y

_FMI

=

1

n

y

i,end

d

i,accumi=1

n

∑

Directness (D)

Die „Direktheit“ der Migration einer Zelle wird über das Verhältnis der Nettodistanz (dnetto, euklidisch) und der Gesamtdistanz (dgesamt, akkumuliert)

errechnet. Während die Nettodistanz der Länge einer Geraden zwischen dem Anfangs- und Endpunkt einer Zelle entspricht, kommt die Gesamtdistanz der gesamten zurückgelegten Strecke einer Zelle gleich. Eine „Direktheit“ von D → 1 entspricht einer geradlinigen Migration von Anfangs- zum Endpunkt.

Direktheit einer einzelnen Zelle

D

_i

=

d

i,netto

d

i,gesamt

Durchschnittliche Direktheit aller Zellen

D=1

n i=1Di

n

∑

=1

n

di,netto

di,gesamti=1

n

∑

Rayleigh-Test

Der Rayleigh-Test ist ein statistischer Test welcher angibt, ob zirkulär angeordnete Punkte hom*ogen verteilt sind. Die Nullhypothese mit der Aussage über eine hom*ogene Verteilung von Punkten in einem Kreis wird bei einem p-Wert ≤ 0.05 abgelehnt. Demnach liegt bei einem p-Wert ≤ 0.05 eine inhom*ogene Verteilung von Punkten in einem Kreis vor.

Statistische Auswertung

4 ERGEBNISSE

4.1 Zellmigration in der Boyden-Kammer

Durch die porendurchsetzte Membran der Boyden-Kammer findet der Aufbau eines Konzentrationsgradienten in die eine, sowie Zellmigration in die andere Richtung statt. Nach Befüllen der Boyden-Kammern migrieren die Zellen in die Richtung des Lockstoffes.

4.1.1 Einfluss von FCS auf die Migration von HT-1080 Zellen

Die Zellkultur-Inserts der Boyden-Kammern wurden mit 0,5 ml einer 2 x 105 HT-1080 Zellen/ml Zellsuspension befüllt. Eine Versuchsreihe bestand aus einer Lockstoffmessung (+/-) und zwei Referenzmessungen (+/+) und (-/-). Während bei der Lockstoffmessung das untere Kompartiment mit einer 10%-igen FCS-Lösung (Lockstoffmedium) und das obere Kompartiment mit Hungermedium befüllt wurden, wurden die Kompartimente der Referenzmessungen gleichermaßen entweder mit Lockstoff- oder Hungermedium befüllt. Referenzmessungen mit Lockstoff- oder Hungermedium in beiden Kompartimenten wurden als "Positivkontrolle" (+/+) bzw. "Negativkontrolle" (-/-) bezeichnet.

Tabelle 4.1 Mittelwerte aller durchgeführten Versuche in der Boyden-Kammer

Zahl der

Experimente Zellzahl

Standard-

abweichung p-Wert

HT-1080 -/- n = 3 301 68,9 0,0033

+/- n = 3 15041 1489,5

+/+ n = 3 7527 911,9 0,0035 0,0051

HUVEC -/- n = 3 3307 239,6

+/- n = 3 17908 2695,9 0,0107

FaDu/- n = 3 35968 10944,6 0,0354 0,0961

Der p-Wert entspricht der Testgröße des t-Tests für unabhängige Stichproben, mit dem untersucht wurde, ob sich die Chemotaxisversuche mit Gradient (+/-) , (FaDu/-) signifikant von denen ohne Gradient (+/+) , (-/-) unterscheiden. Grüner und roter p-Wert beziehen sich auf die Referenzmessungen (+/+) und (-/-) im HT-1080 Experiment bzw. auf die Lockstoffmessungen (+/-) und (FaDu/-) im HUVEC Experiment.

Abbildung 4.1 Schematische Darstellung aller Boyden-Kammer-Versuche. Jede Raute (HT-1080)

und jeder Kreis (HUVEC) repräsentiert die ausgezählte Zellzahl eines einzelnen Versuches. Referenzmessungen ohne Gradient (-/-) und (+/+) sind weiß, Lockstoffmessungen sind grün markiert. Gezeigt sind die Ergebnisse aus drei unabhängigen Versuchen.

Tabelle 4.1 zeigt, dass die höchste Transmigration im HT-1080 Experiment bei der Lockstoffmessung (+/-) stattgefunden hat. Hier sind mit einer mittleren Zellzahl von 15041 Zellen/Membran 50 mal so viele Zellen durch die Membran gewandert als in der Messung ohne Lockstoff (-/-) und doppelt so viele als in der Messung, bei der sich Lockstoff in beiden Kompartimenten der Boyden-Kammer (+/+) befand. Die ermittelten p-Werte von p=0,0035 und p=0,0033 zeigten einen signifikanten Unterschied in der Zellmigration zwischen der Lockstoffmessung und der Positiv- bzw. Negativkontrolle. Trotz Fehlen eines Gradienten in den

0 10000 20000 30000 40000 50000

Z

el

lza

h

l

beiden Referenzmessungen (+/+) und (-/-) zeigte sich mit einem p-Wert von 0,0051 (grüner Wert in Tabelle 4.1) ein signifikanter Unterschied zwischen der Positiv- und Negativkontrolle. Die Lockstoffzugabe in beiden Kompartimenten der Boyden-Kammer führte hier zu einer Steigerung der Zellmigration um das 25-fache.

Abbildung 4.2 zeigt exemplarisch die gefärbten Membranen eines Versuchsaufbaus mit HT-1080 Zellen. Hier ist zu sehen, dass deutlich mehr Zellen in (+/-) durch die Membran migrierten als in (-/-) und (+/+).

Negativkontrolle (-/-) 10 % FCS (+/-) Positivkontrolle (+/+)

Abbildung 4.2 Durchlichtmikroskopische Aufnahmen (200-fache Vergrößerung) einer

Boyden-Kammer-Membran mit gefärbten HT-1080 Zellen; der Kontrast der Fotos wurde nachträglich für eine bessere Darstellung erhöht.

Abbildung 4.3 Darstellung der Zellmigration über die Zellzahl. Nach einer Inkubationszeit von 6 h

wurden die HT-1080 Zellen, die durch die Membran migriert sind, im Mikroskop ausgezählt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei unabhängigen Experimenten.

Im Anschluss wurde das Migrationsverhalten von menschlichen Endothelzellen (HUVEC) in der Boyden-Kammer untersucht.

0 4000 8000 12000 16000 20000

Z

el

lza

hl

4.1.2 Einfluss von konditioniertem FaDu-Überstand auf die

Migration von HUVEC

Der Versuchsaufbau zur Messung der Migration von HUVEC war bis auf die Positivkontrolle äquivalent zu dem von HT-1080 Zellen. Statt der Positivkontrolle wurde für eine bessere Nachahmung der in vivo Situation eine weitere Lockstoffversuchsreihe durchgeführt. Bei dem zweiten Lockstoff wurde Überstand von gehungerten Hypopharynx-Karzinomzellen (FaDu) verwendet (FaDu/-). Auch hier erfolgte die Auswertung über Auszählen der migrierten Zellen auf der Unterseite der Membran. Abbildung 4.4 zeigt repräsentative Ausschnitte von Boyden-Kammer-Membranen mit HUVEC mit FCS (+/-) und konditioniertem FaDu-Überstand (FaDu/-) als Lockstoff im unteren Kompartiment und ohne Lockstoff (-/-).

Negativkontrolle (-/-) 10 % FCS (+/-) FaDu-Überstand (FaDu/-)

Abbildung 4.4 Durchlichtmikroskopische Aufnahmen (200-fache Vergrößerung) einer

Boyden-Kammer-Membran mit gefärbten HUVEC; der Kontrast der Fotos wurde nachträglich für eine bessere Darstellung erhöht.

Abbildung 4.5 Darstellung der Zellmigration über die Zellzahl. Nach einer Inkubationszeit von 6 h

wurden HUVEC, die durch die Membran migriert sind, im Mikroskop ausgezählt. Mittelwerte und Standardabweichungen stammen aus drei unabhängigen Experimenten.

0 10000 20000 30000 40000 50000

Z

el

lza

hl

Auch hier konnten deutlich mehr Zellen auf der Unterseite der Membran ausgezählt werden, wenn sich im unteren Kompartiment ein Lockstoff befand. Während im Mittel 3307 Zellen durch die Membran migrierten wenn kein Lockstoff (-/-) zugegen war, konnten im Mittel 17908 Zellen durch eine 10%-ige FCS-Lösung (+/-) und im Mittel 35968 Zellen durch konditionierten FaDu-Zellkulturüberstand (FaDu/-) auf der Unterseite der Membran ausgezählt werden. Die beobachteten Unterschiede in der Migration von HUVEC waren mit p-Werten von 0,0107 für (+/-) und 0,0354 für (FaDu/-) ebenfalls signifikant. Befand sich im unteren Kompartiment FaDu-Überstand (FaDu/-) sind im Mittel doppelt so viele Zellen durch die Membran gewandert als bei den Versuchen mit Vollmedium (+/-) als Lockstoff. Mit einem p-Wert von 0,0961 (roter Wert in Tabelle 4.1) war der beobachtete Unterschied der Lockstoffmessungen (+/-) und (FaDu/-) nicht signifikant.

Im Anschluss wurde das Migrationsverhalten der gleichen Zelllinien im µ-Slide Chemotaxis untersucht.

4.2 Migrationsverhalten im

µ

-Slide

4.2.1 Direkte Migration von HT-1080 Zellen auf ein Gradient

aus FCS

Um willkürliche Chemokinese von gerichteter Chemotaxis zu unterscheiden wurden pro Experiment zwei Kontrollmessungen durchgeführt. Bei der Negativkontrolle (-/-) wurde die Zellmigration in Hungermedium ohne Zugabe eines Lockstoffes beobachtet. Bei der Positivkontrolle (+/+) wurden beide Reservoire mit Vollmedium befüllt. Zuletzt enthielt im (+/-) Versuch nur eines der beiden Reservoire FCS als Lockstoff. Da jedes µ-Slide drei Kammern beinhaltet konnten pro Versuchsaufbau ein (+/-) Versuch sowie die beiden Referenzmessungen (+/+) und (-/-) durchgeführt werden. Jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt. Die Quantifizierung der Zellmigration erfolgte über die Parameter COM, FMI, Rayleigh-Test, Zellgeschwindigkeit und Directness, welche im Folgenden kurz erläutert werden sollen.

und deuten auf chemotaktisch induzierte Einflüsse hin. Die „Directness“ beschreibt die Tendenz einer Zelle in einer geraden Linie zu wandern. Eine Direktheit von D ≥ 1 entspricht einer geradlinigen Migration vom Start- zum Endpunkt. Inwieweit sich Chemotaxis über diese Parameter ausdrücken lässt bleibt zu prüfen und soll im Folgenden diskutiert werden.

Die Mittelwerte aller Experimente wurden in Tabelle 4.2 zusammengefasst. Die Parameter COM, FMI und Rayleigh-Test sind ergänzend zu Tabelle 4.2 in Abbildung 4.6 graphisch zusammengefasst. Die in Abbildung 4.7 dargestellten Migrationsverläufe der Zellen stammen exemplarisch aus einem Experiment. Da sich der forward migration index aus den beiden Werten y- und x-FMI zusammensetzt, sind die FMI-Werte zur besseren Veranschaulichung in Tabelle 4.3 zusammengefasst und die y-FMI-Werte der Lockstoffmessungen farblich hinterlegt.

Tabelle 4.2 Mittelwerte aller im µ-Slide gewonnener Migrationsparameter

COM (center of mass), FMI (forward migration index) mit y-FMI = FMI|| _{parallel und x-FMI = FMI}⊥_{senkrecht zum}

Gradienten, p-Value (Rayleigh-Test), Directness (Direktheit), Velocity (Zellgeschwindigkeit).

COM

[µm/24h]

FMI

|| ⊥

p-Value

(Rayleigh-Test)

Directness Velocity

[µm/h]

HT-1080 -/- 6,2 0,01 0,01 0,59 0,15 18,6

+/+ 2,0 0,00 0,01 0,73 0,13 43,2

+/- 125 0,22 -0,02 6,4425E-06 0,31 22,8

HUVEC -/- 14,5 0,08 0,09 0,18 0,4 14,1

+/- 38,3 0,14 -0,01 6,8488E-05 0,27 23,2

FaDu/- 42,8 0,18 0,08 0,0011 0,4 15,5

Tabelle 4.3 FMI-Mittelwerte von (A) HT-1080 Zellen und (B) HUVEC

mit FMIII parallel und FMI⊥ senkrecht zum Gradienten. FMIII-Werte der Lockstoffmessungen sind grün markiert.

A B

HT-1080 FMI|| FMI⊥

-/- 0,01 0,01

+/+ 0,00 0,01

+/- 0,22 -0,02

HUVEC FMI|| FMI⊥

-/- 0,08 0,09

+/- 0,14 -0,01

A

-/- +/+

+/-D

-/- +/- FaDu/-B

-/- +/+

+/-E

-/- +/- FaDu/-C

-/- +/+

+/-F

-/- +/- FaDu

/-Abbildung 4.6 Schematischer Vergleich von (A,D) COM, (B,E) FMIII und (C,F) p-Value

(Rayleigh-Test) der (A-C) HT-1080 und (D-F) HUVEC Versuchsreihe. Jede Säule entspricht einem Mittelwert

aus drei unabhängigen Versuchen mit Standardabweichungen. Referenzmessungen ohne Gradienten sind als weiße Säulen, Lockstoffmessungen als grüne Säulen dargestellt. Die in (A, B, D, E) angegebenen p-Werte entsprechen der Testgröße des t-Tests für unabhängige Stichproben, mit dem untersucht wurde, ob sich Lockstoffmessungen signifikant von ihren jeweiligen Negativkontrollen unterscheiden. (C, F) p-Werte des Rayleigh-Tests auf einer logarithmischen Skala. Die gestrichelte Linie markiert die 0,05-Grenze, ab der eine inhom*ogene Zellverteilung stattgefunden hat.

0 50 100 150

COM [µm]

*

{

*

p = 0,0006

0 50 100 150

COM [µm]

*

{

*

p = 0,008

*

p = 0,001

0 0,1 0,2 0,3

FMIII

*

{

*

p = 0,0008

0 0,1 0,2 0,3

FMIII

*

{

*

p = 0,01

*

p = 0,0001

p-value (Rayleigh)

10-­‐6

10-­‐4

10-­‐2

100

p-value (Rayleigh)

10-­‐6

10-­‐4

10-­‐2

Abbildung 4.7 Migrationsverlauf von HT-1080 Zellen und HUVEC in dem µ-Slide. Beschriftungen im rechten oberen und unteren Quadranten zeigen verwendete Medien der beiden Reservoire einer µ

-A D

B

C

E

Versuchsreihe weder auf die Lockstoff- noch auf die Referenzmessungen zutrifft. Mit einer mittleren Zellgeschwindigkeit von 43,2 µm/h wanderten die Zellen in der Positivkontrolle (+/+) am schnellsten. Im Vergleich dazu wanderten die Zellen in der Lockstoffmessung (+/-) mit einer mittleren Zellgeschwindigkeit von 22,8 µm/h und in der Negativkontrolle (-/-) mit 18,6 µm/h nur annähernd halb so schnell. In Abbildung 4.6 ist zu sehen, dass sich der COM- (A) sowie der FMIII-Wert (B) der Lockstoffmessung mit einem p-Wert von 0,0006 bzw. 0,0008 signifikant von denen der Negativkontrolle unterscheiden.

Abbildung 4.7 B zeigt, dass von 57 „getrackten“ HT-1080 Zellen mit 49 Zellen, welche in den oberen beiden Quadranten gezählt werden können (schwarze Bahnen), 86 % Richtung Lockstoff migrierten. Dahingegen wanderten in den Referenzmessungen annähernd gleich viele Zellen in die positive und negative y-Achsen-Richtung. Von insgesamt 94 verfolgten Zellen befanden sich in der Positivkontrolle (Abbildung 4.7 C) nach 24 Stunden 52% in den oberen (schwarz) und 48% der Zellen (rot) in den unteren Quadranten. Bei der Negativkontrolle (Abbildung 4.7 A) konnten von 50 Zellen 54% „oben“ und 46% „unten“ gezählt werden.

4.2.2 Direkte Migration von HUVEC im

µ

-Slide

5 DISKUSSION

Heute ist bekannt, dass Chemotaxis in vielen physiologischen sowie pathologischen Prozessen, wie Angiogenese, Immunantwort, Tumorwachstum und –metastasierung, eine entscheidende Rolle spielt. Die Forschung im Bereich der Chemotaxis stellt inzwischen einen wichtigen Grundsatz zur Entwicklung neuer Therapieansätze bei der Bekämpfung von malignen Tumoren und chronisch entzündlichen Erkrankungen dar. Effektive Systeme zur Messung der Chemotaxis sind daher zu einem erstrebenswerten Ziel in der Forschung geworden. Dabei hat sich die Boyden-Kammer zu einem der meist genutzten Testverfahren für Chemotaxismessungen etabliert. Dem Versuchsaufbau liegt das Prinzip zweier durch eine durchlässige Membran getrennter Kompartimente zugrunde. Indem die Kompartimente mit Flüssigkeiten unterschiedlicher Konzentrationen gefüllt werden, kommt es über Diffusion durch die Membran zur Bildung eines Gradienten. Zellen des oberen Kompartimentes können die Membran auf Grund des Porendurchmessers von 8 µm nicht passiv sondern nur über aktive Transmigration überwinden. Das Maß an Chemotaxis wird rein quantitativ über die Ermittlung der Zellzahl auf der anderen Seite der Membran dargestellt. Aufgrund der simplen Versuchsdurchführung ist es zu einer weiten Verbreitung dieser Methode, welche noch von vielen Forschern (2-Kammer-Systeme) modifiziert wurde, gekommen. Jedoch birgt diese Methode gewisse Nachteile. Den 2-Kammer-Systemen mangelt es unter anderem an der Möglichkeit zur Lebendzellmikroskopie sowie an einem stabilen Gradienten-aufbau. Alternative Testverfahren, so auch das 2007 auf den Markt gebrachte µ-Slide Chemotaxis der Firma Ibidi, wurden entwickelt.

5.1 Bewertung der Ergebnisse

5.1.1 Chemotaxis in der Boyden-Kammer

Es wurde die chemotaktische Wirkung von FCS auf HT-1080 Zellen sowie FCS und FaDu-Überstand auf HUVEC in der Boyden-Kammer untersucht.

Möchte man einer Substanz eine chemotaktische Wirkung zuschreiben, so sollte diese in der Boyden-Kammer eine erhöhte Zellzahl transmigrierter Zellen im Gegensatz zu seinen Referenzmessungen, welche den Lockstoff in beiden oder in keiner von beiden Kammern enthalten, auslösen. So können hohe Zellzahlen in Lockstoffmessungen im Vergleich zu niedrigen Zellzahlen auf der Unterseite der Membran in Referenzmessungen, darauf hinweisen, dass es sich im Falle der Lockstoffmessung um Chemotaxis handelt (Keller 1966, Phelps 1969). Bei beiden Zelllinien konnte mit Hilfe des t-Testes für unabhängige Stichproben ein signifikanter Unterschied in der Zellzahl zwischen den jeweiligen Kontrollmessungen ohne Gradient (-/-) und (+/+) und den Messungen mit Gradient (+/-) und (FaDu/-) gezeigt werden. In anderen Worten fand deutlich mehr Zellmigration statt, wenn ein Lockstoff zugegen war.

Da eine Transmigration ein aktives Durchwandern der Zellen durch die Poren bedeutet, sollten die Zellen in den Messungen ohne Gradient in der oberen Kammer bleiben. Dies wäre bei den Negativkontrollen (-/-) beider Zelllinien sowie bei der Positivkontrolle (+/+) der HT-1080 Versuchsreihe zu erwarten. Wie die gemessenen Zellzahlen in Tabelle 4.1 jedoch zu erkennen geben, hat entgegen den Erwartungen trotz Fehlen eines Gradienten Transmigration statt gefunden. So migrierten im HT-1080 Experiment im Mittel 7,5% der Zellen bei der Positivkontrolle (+/+) und 0,3% bei der Negativkontrolle (-/-) auf die Unterseite der Boyden-Membran; in der Negativkontrolle des HUVEC Experimentes 3,3%. Weiterhin sollte kein signifikanter Unterschied zwischen der Negativkontrolle (-/-) und der Positivkontrolle (+/+) zu vermessen sein, da es in beiden Fällen nicht zu einem Konzentrationsgefälle über der Membran kommt. Trotz alledem zeigte sich bei der Positivkontrolle (+/+) mit im Mittel 7527 Zellen eine um das Fünffache erhöhte Zellmigration auf der Unterseite der Membran als bei der Negativkontrolle (-/-) mit im Mittel 301 Zellen (p-Wert 0,0051). Die Ergebnisse zeigen, dass in Gegenwart eines Konzentrationsgefälles signifikant mehr Zellen durch die Membran wandern als ohne Gradient, es aber auch ohne Gradient zu einer aktiven Transmigration kommt. Da die Zellen durch den Versuchsaufbau bestehend aus zwei Kammern der Schwerkraft ausgesetzt werden, könnte dies eine Erklärung dafür sein, warum sowohl in der Positivkontrolle als auch in der Negativkontrolle Zellmigration stattgefunden hat. Die erhöhte Zellmigration, welche bei der Positivkontrolle (+/+) der HT-1080 Versuchsreihe gemessen werden konnte, könnte durch eine erhöhte Zellmotilität ausgelöst durch die höhere Konzentration an Nährmedium erklärt werden. So könnte ungerichtete Zellbewegung statt zielgerichteter Chemotaxis die Ursache für die vermessene Zellmigration in den Referenzmessungen sein (Keller, Borel et al. 1972).

5.1.2 Chemotaxis im

µ

-Slide

Auch die Zellgeschwindigkeit scheint kein geeignetes Charakteristikum für Chemotaxis zu sein. Bis auf die relativ hohe mittlere Zellgeschwindigkeit der HT-1080 Positivkontrolle (43,2 µm/h) zeigen die restlichen Messungen beider Zelllinien Werte um 20 µm/h. Obgleich die Zellgeschwindigkeit kein Maß für Chemotaxis darstellt, kann sie dennoch für detaillierte Zellbeobachtungen hinzugezogen werden, da die im µ-Slide gemessenen Zellgeschwindigkeitengänzlich im Rahmen der beschriebenen Literaturangaben liegen. Mit 10-20 µm/h und 30-40 µm/h gehören HUVEC bzw. HT-1080 Zellen im Gegensatz zu Leukozyten, welche sich vergleichsweise mit Geschwindigkeiten bis zu 900 µm/h fortbewegen, zu den langsam migrierenden Zellen (Martin, Mansel et al. 2001, Lefort and Kim 2010, Said, Guilbert et al. 2012).

In Abbildung 4.7 sind die Migrationsverläufe jeder einzelnen Zelle sowie die COM-Werte aller Zellen in ihrer Summe über einen Zeitraum von 24 Stunden dargestellt. Der COM-Wert gibt als Schwerpunkt der Streckenendpunkte aller Zellen eine Richtung an, in welche die Mehrzahl der Zellen migriert ist. Demnach wäre bei Lockstoffmessungen eine Verlagerung des „center of mass“ vom Ursprung zu erwarten. Dies wiederum würde hohe COM-Werte für Lockstoffmessungen sowie kleine Werte für Kontrollmessungen bedeuten. In Abbildung 4.7 liegen bei allen Kontrollmessungen (+/+) und (-/-) die mit einem ⊗-Symbol markierten COM-Werte nahe am Nullpunkt, während die COM-Werte der Lockstoffmessungen deutliche Abweichungen vom Ursprung anzeigen. Wie in Abbildung 4.6 ersichtlich konnten signifikante Unterschiede im COM-Wert zwischen Lockstoffmessungen und zugehörigen Kontrollen für beide Zelllinien vermessen werden. Im HUVEC Versuch zeigten sich p-Werte von 0,008 und 0,001 für (+/-) bzw. (FaDu/-) in Bezug auf die Negativkontrolle (-/-). Niedrige p-Werte von 0,0006 und 0,0005 für (-/-) bzw. (+/+) in Bezug zur Lockstoffmessung (+/-) konnten im HT-1080 Versuch aufgezeigt werden. Es lässt sich daher abschließend sagen, dass es in Anwesenheit eines Gradienten (+/-) und (FaDu/-) bei HT-1080 sowie HUVEC zu einer deutlichen Verlagerung des „center of mass“ vom Ursprung kommt und somit der COM-Wert klar in Zusammenhang mit vermessener Chemotaxis im µ-Slide gebracht werden kann.

relativ hohe p-Werte des Rayleigh-Tests in allen Kontrollmessungen beider Zelllinien bestätigt. Wie in Tabelle 4.2 ersichtlich liegen die mittleren p-Werte des Rayleigh-Tests für die HT-1080 Versuchsreihe mit 0,59 (-/-) und 0,73 (+/+) und für die HUVEC Versuchsreihe mit 0,18 (+/+) deutlich über 0,05 (siehe auch Abbildung 4.6). Dahingegen deuten die p-Werte aller Lockstoffmessungen mit 6,44⋅10-6 (+/-) der HT-1080 Versuchsreihe und 6,85⋅10-5 (+/-) und 0,0011 (FaDu/-) der HUVEC Versuchsreihe sowie auch die Migrationsverläufe in Abbildung 4.7 B, E und F auf eine inhom*ogene Zellverteilung. Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass sich Chemotaxis im µ-Slide nicht nur bildlich sondern auch mathematisch im Rayleigh-Test ausdrücken lässt.

Insofern stellen die Parameter COM, FMI und p-Wert des Rayleigh-Testes ein gutes Maß für die Charakterisierung von Chemotaxis dar, während Zellgeschwindigkeit, Direktheit und Videomikroskopie zusätzliche Informationen über Zellverhalten und -motilität liefern.

5.1.3 Boyden-Kammer- und

µ

-Slide-Ergebnisse im Vergleich

denen sich die Unterscheidung von zufälliger Migration und gerichteter Chemotaxis, berechnen lässt. Unter anderem beschreibt Zigmond et al. in seiner Arbeit Berechnungen mit denen sich grob die Distanz, welche Zellen erwartungsgemäß in dicken Filtern in Abwesenheit von Chemotaxis zurücklegen, schätzen lässt (Zigmond and Hirsch 1973). Büttner et al. wiederum schließt unter Verwendung zweier Parameter, den sogenannten "random motility coefficient, mu" und "chemotaxis coefficient, chi", auf eine intrinsische Zellbewegung, welche sich unabhängig von äußeren physikalischen Einflüssen verhält (Buettner, Lauffenburger et al. 1989). Eingehende Berechnungen erfordern wiederum zusätzliche Versuchsansätze unter Verwendung unterschiedlicher Konzentrationen und gestalten den anfangs einfachen Versuchsaufbau der Boyden-Kammer komplexer.

Des Weiteren fällt auf, dass sich die Ergebnisse der Referenzmessungen (-/-) und (+/+) des HT-1080 Versuchs in der Boyden-Kammer von denen im µ-Slide unterscheiden. Während Zellmigration der Positivkontrolle (+/+) im HT-1080 Versuch durch die Boyden-Membran erhöht stattfindet, zeigt sie im µ-Slide keinen Unterschied zur Negativkontrolle. Im Boyden-Kammer-Versuch zeigt sich sogar ein signifikanter Unterschied zwischen Positiv- und Negativkontrolle mit einem p-Wert von 0,0035, obwohl in beiden Fällen kein Konzentrationsgefälle auf die Zellen wirkt. Zellmigration der Positivkontrolle im µ-Slide kann bei Betrachtung des Migrationsverlaufs in Abbildung 4.7 C vermessen werden, doch ist diese nicht als gerichtet zu bewerten. Die erhöhte Zellmigration durch die Boyden-Membran in Abwesenheit eines Gradienten ist daher eher durch eine erhöhte Zellmotilität im Sinne einer chemokinetischen (weniger einer chemotaktischen) Zellreaktion zu erklären. Auch kann im µ-Slide, in welchem sich die Zellen in einer Ebene bewegen, die Schwerkraft außer Betracht gelassen werden, welche in der Boyden-Kammer, bei der sich die Zellen von oben nach unten bewegen, definitiv eine Rolle spielt.

5.2 Vor- und Nachteile beider Systeme

Rückblickend auf die in der Einleitung beschriebene Entwicklung Chemotaxis-messender Systeme können die Kriterien, die ein gutes Testverfahren ausmachen, gesetzt werden. Dabei haben sich in Bezug auf ein Chemotaxis-messendes Verfahren vier Kriterien besonders hervorgehoben:

- einfacher Versuchsaufbau - Möglichkeit der Zellbeobachtung - stabiler Konzentrationsgradient - Reproduzierbarkeit

Boyden-Kammer und µ-Slide sollen nun im Hinblick auf diese Kriterien verglichen werden.

Der Hauptvorteil der Boyden-Kammer liegt offensichtlich im einfachen Versuchsaufbau. Das Prinzip und die Versuchsanweisungen sind leicht verständlich und anwenderfreundlich. Unter Einbeziehung der Zellauszählung liegt die durchschnittliche Versuchsdauer bei ca. 8 Stunden, der Nettoarbeitsaufwand nach Abzug der nötigen Inkubationszeit sogar nur bei 1-2 Stunden. Dies ermöglicht eine simultane Durchführung vieler Versuchsansätze. Allerdings stellt die Zählung der migrierten Zellen eine Fehlerquelle dar. Dies kommt zum einen durch die oben genannten ungenauen Randbereiche zustande. Des Weiteren erwies sich das Wegwischen der Zellen mit einem Wattestäbchen auf der Oberseite der Membran als problematisch, da unter anderem Zellen, welche sich in den Poren befanden, ebenfalls weggewischt wurden. Die Interpretation der Ergebnisse stellt sich wiederum unkompliziert dar. Während sich im Boyden-Versuch lediglich endliche Zellzahlen von Lockstoff- und Referenzmessungen gegenüber stehen, ist die Interpretation der µ-Slide Ergebnisse aufwendiger. Zum Beispiel sind die beiden FMI-Werte (parallel und sekrecht zum Gradienten) nur in Beziehung zueinander aussagekräftig.

Pipettiergeschwindigkeit muss geachtet werden. Zu schnelles Befüllen des Beobachtungskanals oder der Reservoire kann zum Austreten der Zellen aus dem Kanal oder zum Auftreten von Luftblasen im System führen. Sogar das Aufsetzen der Stöpsel muss exakt und behutsam durchgeführt werden. Auch hier kann es zu Luftblasenbildung oder Zellaustritt kommen, beachtet man zum Beispiel nicht den genauen Füllzustand der Kamine vor Aufsetzen der Stöpsel. Lange Videomikroskopie- (24 h) und Zell-Adhärenz-Zeiten (2-4 h) führen zu einer Gesamtversuchsdauer von durchschnittlich 30 Stunden. Teures Equipment und technisches Verständnis (Videomikroskopie, Software-gesteuerter Tisch, Heiz- und Inkubationssystem) sind Voraussetzung für die Durchführung des µ-Slide-Experiments.

Genannte Vorzüge machen die Boyden-Kammer zu einer der meist genutzten Methoden für Chemotaxisversuche. Trotz allem sind die gewonnenen Informationen aus einem Boyden-Kammer-Versuch aufgrund der fehlenden Möglichkeit zur Zellbeobachtung während des Migrationsvorganges begrenzt. Eine Analyse von Morphologie, Geschwindigkeit oder Verhalten der Zellen ist mit dieser Methode nicht möglich. Auch kann zielgerichtete Chemotaxis nicht von ungerichteter Chemokinesis unterschieden werden (Wei, Parker et al. 2003). Des Weiteren nehmen diverse Störfaktoren Einfluss auf die gemessene Zellantwort. Beispielsweise hängt das Ausmaß der Zellmigration nicht nur von Zellmotilität, sondern auch von Zellgröße, Zellverformung oder der initialen Zellposition zur Pore ab. Kleine und leicht verformbare Zellen passieren die Membran effizienter als große, weniger verformbare Zellen. Porennahe Zellen überwinden die Membran leichter als porenferne Zellen. Dies könnte die oft beobachtete inhom*ogene Zellverteilung auf der Membran erklären. Da die Zellen von oben nach unten migrieren spielt des Weiteren die Schwerkraft eine Rolle. Außerdem können bereits migrierte Zellen von der Membran fallen und entgehen dabei der finalen Zellzählung (Keller, Borel et al. 1972). Um dem vorzubeugen wurden Methoden beschrieben, bei denen die Zellen, welche in die untere Kammer gefallen sind, mitgezählt werden (Jungi 1975, Campbell, Qin et al. 1996).